在过去的十年中，液体活检技术已经成为传统组织活检技术可行替代的方案，液体活检领域的大多数研究主要集中在以血液为基础的生物标志物，主要使用血浆来源的循环肿瘤DNA(ctDNA)。然而，ctDNA也可以从非血液来源获得，如尿液、脑脊液、胸膜或腹膜液等，可能比血浆ctDNA具有更独特的优势。液体活检技术能够相对容易的获得连续样本，克服一个或多个小组织样本可能不能反映整个肿瘤负担的问题，同时，能够以微创、快速、可重复采样的方式获取有关疾病诊断、预后，及预测的临床信息。
年8月1日，英国曼彻斯特大学NatalieCook团队在NatureReviewsClinicalOncology杂志上发表了题为“CirculatingtumourDNA—lookingbeyondtheblood”的综述，讨论了来自非血液来源的ctDNA的研究进展，讨论了非血液ctDNA为何可以提供比血浆ctDNA更明显的优势，及其与血浆ctDNA之间的互补关系，并进一步探讨了从实验室到临床应用的挑战。
要点
基于血浆的ctDNA检测可以提供病人癌症状态的宝贵信息，然而，ctDNA的许多替代来源可能在某些环境中具有独特的优势
ctDNA的非血液来源包括尿液、脑脊液、胸膜或腹膜液、唾液、粪便和精液等
对特定肿瘤类型或解剖位置，分析非血液来源的ctDNA可能比基于血浆的ctDNA更灵敏
用于检测驱动改变或耐药机制时，非血液ctDNA可能是血浆分析的补充
非血液ctDNA分析临床实施的挑战，包括分析前因素标准化的困难，缺乏商业可用的分析方法，以及获取特定样本类型所需的侵入性程序
“液体活检”是指在生物液体（传统上是血液）中发现的生物标志物，对其取样，以提供具有关患者及其潜在恶性肿瘤的临床有价值的信息。
cellfreeDNA(cfDNA)是指位于细胞外且可以在体液中检测到的DNA片段。ctDNA是来源于癌细胞的cfDNA部分，通常由bp的链组成。有研究表明，血浆ctDNA中检测到的基因组改变与肿瘤组织中发现的基因组改变高度一致。然而，ctDNA释放的机制包括肿瘤细胞凋亡、肿瘤细胞直接释放、吞噬肿瘤细胞后巨噬细胞分泌，以及较小程度的循环肿瘤细胞（circulatingtumourcells，CTCs）释放等假设，仍不明确。
与从血液中分离的ctDNA相比，来自非血液来源的造血细胞的cfDNA相对缺乏，这意味着ctDNA可能以更高的相对浓度和更高的变异等位基因频率（VAFs）存在。非血液来源的ctDNA可能更能反映原发肿瘤（如晚期胸腔恶性肿瘤患者的胸膜液样本），或者也可能能够表征基因上不同的肿瘤细胞群（如颅内疾病患者脑脊液中的肿瘤细胞）。
ctDNA检测方法包括数字PCR(dPCR)的技术检测特定的突变、靶向下一代测序，以及全外显子组测序或全基因组甲基化状态分析等方法。检测方法同样适用于来自血浆和非血液的ctDNA。ctDNA有大量的替代来源，这些样本的几种作用正在显现（图1、2）。与血浆中获取的ctDNA相比，每一种都有其优点和缺点(图3、4)。
图1.使用非血液来源ctDNA分析的不同癌图2.非血液ctDNA在癌症临床路径不同阶图3.血浆ctDNA的优缺点图4.非血液来源ctDNA的优缺点
尿液ctDNA
尿液中的ctDNA由两个不同的部分组成。第一种是经肾肿瘤DNA(trtDNA)，它来源于血浆，通过肾小球过滤进入尿液，因此大小有限（通常为bp）。此前，低浓度的trtDNA限制了这种类型的ctDNA的分析，目前已通过NGS等现代分析方法得到部分解决。第二种来源于直接从泌尿道脱落的肿瘤细胞，由于没有经过肾过滤，可以有更大的分子量。
trtDNA
分析尿液ctDNA最显著的优势是能够完全无创地获得样本，在采样过程中无需取血或医疗保健专业人员在场。尿液样本可能不太容易被白细胞溶解释放的cfDNA稀释ctDNA影响，因此尿液能够直接评估泌尿系统癌症释放的ctDNA。
尽管具有一些理论上的优势，尿液ctDNA检测的发展仍远不及基于血液的ctDNA检测，并且存在一些应予以强调的缺点。
首先，trtDNA必须通过肾小球，将分子量限制在bp。其次，肾小球滤过率控制着尿液trtDNA的积累速度，并且具有很大的波动性，尤其是在接受全身抗癌治疗的患者中。另一个潜在的缺点是排尿量通常很大，对ctDNA产生稀释，而使用大体积样品对cfDNA进行分离处理在技术上也更具挑战性。
rtDNA分析显示出包括胃癌、结直肠癌、胰腺癌和卵巢癌，以及中枢神经系统(CNS)淋巴瘤等癌种类型同样具有实用性。基于dPCR方法分析结直肠癌(CRC)患者血浆和尿液ctDNA的KRAS和BRAF突变，结果显示，尿液ctDNA的敏感性和特异性分别为85.5%和%，与组织分析的总体一致性为91%，与血浆ctDNA相似（）敏感性87.3%，特异性%，总体一致性92%）。同样，全外显子测序证实，分析CRC患者尿液样本中trtDNA是一种可行早期检测方法；然而，在一项涉及24名患者的研究中，只有4名患者的trtDNA水平足以进行分析，因此突出了目前与该方法相关的挑战。
由于无创的采样过程，trtDNA可作为治愈性治疗后监测疾病状态的方法。研究发现，早期乳腺癌患者的trtDNA水平在手术后下降（手术后6个月内下降2.1倍），6个月时trtDNA绝对浓度更高（HR1.71,95%CI1.28-2.28），与基线相比变化更大（HR2.42，95%CI1.88-3.33），可预测3年内疾病复发。
因此，医院就诊的策略相比，在治愈性治疗后定期进行尿液取样（可以在家中进行，样本通过邮寄方式返回），可以早期发现疾病复发，并且具有更高的患者依从性。
ucfDNA
发生在尿道内的膀胱癌、前列腺癌和肾癌可以直接将DNA片段释放到尿液中。不同研究小组的研究表明，与未患癌症或患有泌尿系统良性疾病的患者相比，处于晚期疾病的患者，膀胱癌患者的尿液cfDNA(ucfDNA)浓度更高。
对ucfDNA在尿路上皮癌患者疾病监测和复发预测中的应用进行了研究。研究表明，在疾病进展的患者中发现高浓度的ucfDNA，而血浆ctDNA无法检测到。在临床进展前几个月检测到了高浓度的ucfDNA，尿液可用于膀胱癌的基因组分析。
ucfDNA的非侵入性，以及早期证据表明检测的可行性，增加了其用于泌尿系统癌症早期检测潜力。UroSEEK是一种基于特异多重PCR的检测方法，用于尿路上皮癌的早期检测，并在名有血尿或下尿路症状提示的患者队列中进行了检测。UroSEEK单独检测确定了83%的被诊断患有膀胱癌的患者，当与尿细胞学相结合时，该检测方法的敏感性增加到95%，特异性为93%。因此，ucfDNA为尿路上皮癌患者提供了一种很有前途的早期癌症检测和/或监测疾病进展或复发的方法。
聚焦于ucfDNA的分析有以下几个优点：与血浆ctDNA类似，可以避免肿瘤异质性对单个组织活检样本准确性的影响。此外，医院就诊即可轻松进行连续监测的简易性为泌尿系癌症患者提供较好的就诊体验。目前仍缺乏更大规模的前瞻性试验以支持该技术的临床应用。
脑脊液ctDNA
对于颅外恶性肿瘤患者，液体活检的目的通常不是取代基于肿瘤组织学诊断的金标准，而是提供治疗反应或疾病复发或识别靶向改变的信息。然而，从中枢神经系统恶性肿瘤患者身上获取肿瘤组织样本具有相当大的挑战性和潜在的危险，因此，液体活检取样在原发性中枢神经系统疾病的诊断和可能的继发性轻脑膜扩散的诊断中具有一定的价值。
血浆ctDNA只在原发性中枢神经系统恶性肿瘤和分离的中枢神经系统转移的患者中出现，通常比非中枢神经系统实体肿瘤患者检测到的浓度更低，这可能是由于血脑屏障限制了ctDNA和CTC的易位。相反，CSF在脑室、蛛网膜下池、脑沟和椎管内的脑实质周围循环，因此，这是来自中枢神经系统肿瘤的ctDNA的绝佳来源。此外，与血浆相比，脑脊液中循环免疫细胞通常较少，这可能会降低脑脊液中cfDNA的总体含量，从而可以更敏感地检测低VAFs中存在的癌症特异性突变。
CSF中ctDNA相对于血浆的相对丰富程度(考虑到获取血浆样本相对容易)是CNS局限性疾病患者使用液体活检取样的一个关键考虑因素。与血浆相比，在脑脊液中较低的VAFs下可以始终检测到ctDNA的改变，当纵向评估时，脑脊液中ctDNA丰度的变化也更能代表肿瘤负担。
在过去的几年中，CSFcfDNA在髓母细胞瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(PCNSLs)、颅内外原发性肿瘤转移中枢神经系统患者颅内病变中发挥重要作用，如用于诊断组织学不明确或无法获得肿瘤材料的患者，用于监测反应和/或检测疾病复发，以及用于特异性耐药机制的检测、监测和表征等。
胸膜和腹膜液ctDNA
胸膜和腹膜液体提供了一个薄的润滑层，减少了胸膜衬里、腹部器官和腹膜之间的摩擦，它们是血液的超滤物，由于缺乏外周血细胞，因此，非造血cfDNA相对富集。肿瘤细胞通过血液或淋巴扩散渗透到胸膜和/或腹膜，因此，恶性胸腔积液（MPE）和腹水可能含有来自肿瘤细胞的ctDNA。
分析胸膜ctDNA的一个优点是样本（通过胸腔积液获得）可立即用于基因检测，而组织样本通常需要按照标准的护理诊断流程进行常规的组织病理学处理。对胸腔积液中ctDNA的组织样本进行平行组织学分析和靶向突变的分子谱分析，可以更早地发现靶向改变，从而更早地选择最合适的治疗方法。一项研究使用基于NGS的个基因分析胸膜液、血浆和组织样本，并报告胸膜液cfDNA中VAFs和突变检出率较高。
许多研究表明，ctDNA在腹膜液中的应用，无论是从恶性肿瘤导致的腹水，还是在手术切除过程中从腹腔灌洗中获得的ctDNA，可能对腹膜疾病的检测和监测都具有很大的效能。一项涉及20例CRC和孤立性腹膜疾病患者的研究表明，所有患者都可检测到腹膜ctDNA，而只有20%的患者可检测到血浆ctDNA，腹膜cfDNA中的VAFs显著升高(16.4%vs.0.28%；P=0.)。小队列研究表明，从术前或术后腹腔灌洗中获得的ctDNA可作为疾病复发的预测因素，并初步报告了令人满意的结果。
唾液ctDNA
唾液是一种不需要专业医护人员在场就可以无创获取的体液。唾液含有细胞、蛋白质和核酸，但远没有血液复杂。在唾液中检测种系DNA的能力已经在法医学和某些医学指标中使用了几十年，如在唾液中可以识别生殖细胞BRCA1/2突变。然而，ctDNA相对于生殖细胞DNA的浓度较低，因此需要更先进的检测技术。唾液ctDNA（sctDNA）具有鉴别头颈部鳞状细胞癌（HNSCCs）和非头颈部鳞状细胞癌的能力。此外，通过血液中ctDNA的被动扩散、主动运输或超滤，sctDNA也可以来源于更远的恶性肿瘤。
鼻咽癌（HNSCC）通常与人乳头瘤病毒（HPV）感染有关。在一项基于口咽鳞状细胞癌患者血浆和唾液样本的研究中，唾液样本能以52.8%的灵敏度（血浆为67.2%）和%的特异度在治疗前检测到HPV16DNA。此外，治疗后唾液中检测到的HPVDNA和HPVDNA浓度均与疾病复发风险显著升高（HR10.7,95%CI2.36-48.50；P=0.）和OS降低（死亡危险比25.9，95%CI3.23-；P=0.）显著相关。在另一项研究中，也证实唾液样本与肿瘤负担相关，并可预测治疗反应。
粪便ctDNA
假设人类DNA通过细胞脱落和结肠细胞凋亡的结合进入粪便。然而，由于胃肠道微生物群数量庞大且种类繁多，人类DNA仅占粪便总DNA含量的0.01%左右，其余来自胃肠道和/或饮食中的细菌。
CRC筛查是目前粪便DNA研究的重要焦点，是非血液ctDNA检测转化为临床应用的最先进的领域之一。其基本原理为早期结直肠病变主要发生在黏膜内，伴随上皮DNA脱落进入结肠腔。使用包含3个KRAS突变、8个TP53突变、10个APC突变、BAT-26突变和一个长链DNA标记的测序组对粪便DNA样本进行分析表明，与粪便免疫化学和隐血试验相比，尽管假阳性结果的风险增加，但CRC检测的敏感性更高。该检测随后被发展为一项FDA独立批准的筛查试验（Cologuard）。该技术的成本效益低于其他替代方法，因此可能不适合用于大规模筛查。Cologuard检测也被用于息肉/腺瘤切除后结肠镜监测的替代方法，这可能会降低患者的成本和负担。
粪便DNA分析的效用也在胰腺癌患者中进行了研究。胰腺分泌物直接进入胃肠道，有研究从胰腺癌或胆管癌患者粪便样本中评估了KRAS突变检测的可行性；在粪便中发现的6个突变中，有5个与被切除的癌中出现的突变相同。利用dPCR检测胰腺癌患者粪便样本中KRAS和DNA甲基化标志物的突变，尽管研究中只有19%的患者同意提供粪便样本，揭示了依从性的局限性。事实上，一些研究已经确定了参与者对粪便抽样的反感，可能会阻碍这种分析方法的广泛应用。
总之，粪便DNA可能作为癌症筛查项目来改善检测结果，并提供关于单个肿瘤的基因组谱的信息，从而为精准医学提供更多可能。目前的挑战包括粪便中很少可检测到肿瘤DNA，对粪便微生物组的了解不足，以及患者不愿提供粪便样本。
精液ctDNA
精液是一种可用于提取ctDNA进行分析的体液，它起源于精囊，构成男性射精的液体成分。游离精液DNA（cfsDNA）的浓度通常高于其他体液中的cfDNA；cfsDNA的相对丰度可能是在提供样本（允许分泌的DNA积累）前禁欲（3-5天）和由于其他精液成分的影响而降低的DNase活性的综合作用。由于精液中含有大量的前列腺分泌物，cfsDNA在男性前列腺癌患者中的应用越来越受到
